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关于植物检疫中一些热点问题的探讨发表于: 2019-04-18 19:36

  2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集关于植物检疫中一些热点问题的探讨 易建平(上海检验检疫局上海200135) 摘要本文就植物有害生物术语标准化、有害生物风险分析及现代生物技术在植物检疫中的应用现 状进行了探讨。提出了在我国尽快规范有害生物名称的使用,以有利于学术交流;阐述了在有害生物风险 分析中应该高度关注长期的生态影响,提出了为切实减少对贸易的影响,提高检疫措施实施的有效性,制 订风险管理措施时应综合考虑各利益攸关方的意见。本文还结合工作实际,对目前广泛使用的分子生物 学鉴定技术进行了评述,提出了规范分子检测鉴定技术的建议。 关键词 有害生物;有害生物风险分析;PCR 频繁的人员流动、环球航行及国际贸易的发 展,有害生物入侵引起的危害正日益成为一个全球 性关注的焦点之一,国际社会进一步提高了对有害 生物入侵的重视程度,有害生物的研究也得到不断 深化,特别是如何在有效降低有害生物风险的前提 下保证贸易安全顺利◆●△▼●进行方面开展了大量研究。 这些研究,使有害生物的鉴定技术及对有害生物的 评估与管理水平得到了极大的提高。本文针对这 些热点,就植物有害生物术语标准化、有害生物风 险分析及现代生物技术在植物检疫中的应用谈谈 粗浅的看法。 1有关术语 近年来,随着人类对环境安全、生物多样性关 注程度的提高,“外来有害生物”等名词频频出现在 报刊、学术期刊,甚至在《植物检疫》等专业期刊上 也经常使用。而“外来有害生物”一词既非《植物 卫生术语》国际标准中认可的术语,也非国际生物 多样性公约组织认可的术语。因此,笔者认▪▲□◁为,类 似的植物检疫术语急需规范。 有害生物(pest)指“任何对植物、植物产品构 成伤害的植物、动物或病原体的种、株(品)系或生 物型”(FAO,2002),包括害虫、病原真菌、病原原 核生物(细菌、植原体、螺原体)、植物病毒(病毒和 类病毒)、有害植物、病原线虫、软体动物等。外来 物种和转基因生物可以是有害生物,也可以是有益 生物。3j。按照IPPC的定义,有害生物可以划分 为检疫性有害生物、限定的非检疫性有害生物及非 限定▷•●的有害生物。FAO/IPPC在定义有害生物时, 已充分考虑了国际社会对入侵物种的关注,但未采 用近年来生态学家频频使用的“入侵物种(invasive 一314一 alien species)”一词。2001年,IPPC在修订术语标 准时,使用“对……构成伤害的(injurious 定有害生物,这样既考虑了对植物造成直接危害的有害生物,同时也包含了通过与植物竞争营养等造 成非直接影响的生物,即包括了国际生物多样性公 约组织(The Convention BiologicalDiversity。 CBD)(2002)对“外来物种”(传人和(或)扩散后 可以影响生物多样性的那些生物)定义的内容J。 在生态学中,按照物种在本地区(或生态区域) 或本国是否存在的地理概念,将物种划分为本地物 种(native species)及外来物种(alien species)心。3]。 根据CBD的定义,外来物种指发生于正常分布区 以外的物种,可以来自国外,也可以来自同一国家 或地区的不同生态区域,但通常指前者。生物入侵 (biological invasion)是指由于人为因素将物种传播 到物种从未生活过的生态系统中定居△▪▲□△并繁衍的现 象。在文献中,对这类外来物种有多个名词,如外 来的(exotic)、异源的(alien)、引进的(introduced)、 迁入的(immigrant)、非本地的(non—native)、非本 土的(non—indigenous)等等。外来人侵种(Mien invasive species)指已经在自然或半自然生态系统 或生境中建立了种群,成为改变和威胁本地生物多 样性的外来物种。 Webb从时空角度阐明了本地物种的概念并明 确了8条判定标准,强调“本地物种是在当地进化。 或在石器时代就达到这些地方或在没有人类干扰 前就出现于这些地方的物种”。从生态学的角度 看,目前国内存在的生物大部分都是“外来”的。对 植物检疫而言,我们应该关注这些“外来”的检疫性 有害生物和限定的非检疫性有害生物。由此可见, 2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集 在植物检疫领域使用IPPC认可的“有害生物”等术 语更加适合。 2关于有害生物风险分析 有害生物风险分析(简称PRA)是利用生物学 或其他科学、经济学证据确定某种生物是否是有害 生物、是否应予以管制以及管制所采取的植物卫生 措施力度的过程(FAO,2007)。PRA是解决农产品 贸易中涉及检验检疫纠纷的基础,是检疫政策调 整、制订的依据。 自20世纪90年代以来,各国高度关注PRA研 J。近年来,国内学者也倾注了大量精力,国家、地方政府等公布的科技项目中均涉及风险评估的 内容。风险评估包括分析入侵风险及定殖风险。 前者系统的、定量的研究较少,比较多的是定性评 估【5一’7l。后者主要通过发生区生态环境的比较等 来预测PRA地区有害生物可能发生的情况。国内 外在此领域已发表了大量研究报道。目前,比较常 用的方法有CLIMEX、GARP、GIS等◁☆●•○△4 通过风险评估确定风险的来源、风险的大小,目的是为制订控制风险的检疫措施提供理论依据。 采取的检疫措施对贸易影响最小是WTO规则的要 求,因此开展检疫措施的效能研究已刻不容缓。目 前采取的检疫措施往往是实施退货、销毁、熏蒸、消 毒等检疫处理、自非疫区(点)进口(包括预检等), 关注的▼▼▽●▽●重点也常常是检疫本身对有害生物影响的 程度,但缺乏对贸易影响的研究、对生态影响的研 究、对社会影响的研究。近年来,国内“水葫芦”泛 滥成灾、“红火蚁”入侵导致的生态危机等事件均从 不同层面呼吁我们应该强化检疫措施的效能及对 生态环境长远影响和经济学影响的•●研究。由于国 内养殖业的发展及耕作制度的改变,生态环境的改 变及河流▲●…△富营养化,使作为“有益”植物引进的水葫 芦成为阻塞河道的“元凶”,这就要求我们在开展引 进植物的风险分析时,需要从不同角度来考察其可 能存在的风险,不能局限在“用于饲料”有益的一 面。红火蚁在入侵我国前并不在国家公布的禁止 名录之列,当初名录的制订主要关注是否危害我国 重要的农作物、经济植物等,对生态的影响未充分 考虑。 有害生物风险管理涉及多个利益群体,如何在 制订风险管理决策过程中体现各利益攸关方的规 定是风险管理中必须考虑的一个重要方面,也是确 保制订可操作的、对贸易影响最小的检疫措施的根 本。如在评估木质包装传带有害生物的风险及相 关风险控制措施有效性时,就涉及包装的生产者、 产品需包装的生产者、产品消费者、运输部门、进口 商、生态学家、普通民众等方方面面的利益群体。 这些群体由于关注的利益不同对风险管理措施的 要求也不尽相同。对生态学家及进口商而言,在有 关木质包装传带有害生物的可能性及传人后扩散 的情况方面他们的意见肯定不一样。可以肯定地 说,在传人阈值、扩散阈值及采取的措施方面他们 观点不同。因为他们关注的目标不同,对进口商而 言他们比生态学家更多关注短期的经济效益,而对 生态学家而◆◁•言往往更多地从长远的生物多样性来 考虑。这些利益攸关方的价值观通常看起来在依 据风险评估过程的科学角度是比较难结合到一起。 从科学决策的角度来看,这些不能结合的意见无论 在科学性方面还是在确定可接受的风险水平时均 会影响有害生物风险管理,这些影响很大程度上是 相互独立并且是不协调的。PRA是检疫决策的科 学基础,加强风险管理措施效能的研究和综合各方 面意见评估对贸易的影响,对促进贸易发展,有效 防止管制的有害生物传人意义重大。 3关于分子诊断技术在有害生物检疫检测鉴定中 的应用 二十世纪五十年代Watson和Crick提出了 DNA双螺旋结构模型,标志着现代分子生物学的诞 生。以分子生物学为代表的现代生物技术的迅猛 发展,极大地推动了生命科学的发展,已成为生命 科学各研究领域的重要工具。分子诊断学是以分 子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方 法研究目的生物大分子和大分子体系的存在、结构 或表达调控的变化,为目的生物的诊断、鉴定和防 控提供信息和决策依据。分子诊断技术主要包括 核酸分子杂交、聚合酶链式反应(PCR)、基因多态 性分析、单链构象多态性(SSCP)分析、DNA测序、 基因芯片以及蛋白质组分析等技术,目前在检疫系 统内应用最广泛的分析方法是聚合酶链式反应 (PCR),通过体外特异性扩增DNA片◆■段来检测目 的物种(微生物或有害生物)从而达到快速检测鉴 定(诊断)的效果。分子诊断技术已经在植物检疫 中显示出强大的生命力和极大的潜力,具有特异性 强、灵敏度高、快速准确等特点。 今天的植物检疫中不断地引入分子诊断技术, 并将其应用于有害生物的检测和种类鉴定,大大提 一315— 2010年进出境植物检疲学术研讨会论▪…□▷▷•文集 高了有害生物检测的准确性、特异性和灵敏度,在 植物有害生物的检测、鉴定和防控等方面发挥了愈 来愈重要的作用。以PCR技术为基础的DNA诊断 技术,特别是定量PCR和实时荧光PCR技术,已经 用于植物病原细菌、真菌、病毒和植原体等检疫性 有害生物的快速检测过程之中,已经制订(修订)以 及将要制订(修订)的检验检疫行业标准中相当部 分引入了分子生物学方法,比如“玉米霜霉病菌检 疫鉴定方法”、“小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方 法”、“椰子致死黄化植原体检测方法”、“椰子死亡 类病毒检测方法”、“西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定 方法”、“马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法”,而且行 业标准和国家标准中分子诊断学的引入趋势还在 不断加大。在实践中,也应看到在引人分子诊断技 术的过程中还存在诸多问题急需解决。在近几年 应用分子诊断技术的过程中,我们遇到有关PCR 引物特异性的事例: 事例一是关于小麦印度腥黑粉菌的检测。 1996年上海口岸曾从美国进口的小麦中截获了一 种类似小麦印度腥黑粉菌的黑粉菌冬孢子,当时用 美国Smith等发表的引物T117M1/2和T15★△◁◁▽▼7M1/2 进行试验,得到了阳性结果,后来应用Frederick等 人设计的引物证明是黑麦草腥黑粉菌…。2003至 2004年间,江苏和天津检疫检疫局对进口黑麦草中 的黑粉菌冬孢子进行PCR检测,结果显示小麦印 度腥黑粉菌和黑麦草腥黑粉菌引物均呈阳性,测序 分析表明截获的黑粉菌冬孢子应该是黑麦草腥黑 粉菌,后来分析认为该假阳性是由于引物的特异性 不足引起的。重复的试验表明,在检测冬孢子时所 用◇=△▲试验条件的改变和扩增的循环次数过多容易引 起假阳性,当时所用的引物是美国Frederick等人 发表的TiIl3/Tin和Tinll/Tin4。此后经过两年多 的试验,上海检疫检疫局针对黑粉菌冬孢子的检测 设计了一系列的通用和特异性引物,解决了此前的 假阳性问题[11-13]。在近期召开的中加油菜检疫会 谈时,加拿大专家报告在检测油菜茎基溃疡病菌 时,也发现试验条件改变和增加扩增循环次数容易 引起假阳性的现象。 事例二是关于火蚁的分子检测。上海检验检 疫局41在利用PCR技术鉴定口岸截获的红火蚁 时,根据GenBank中的火蚁属Solenopsis序列资料 分析coifl/coirl引物和rifa一1探针(陈岩等, 2005)纠的有效性时,发现已经登录的人侵红火蚁 一316一 Solenopsis invicta的线条序列和探针rifa一1序列完全一致,理 论上其余的70个序列的样品应该是阴性;同时理 论上还有9个s.richteri、6个S.quinquecuspis和3 个S.megergates等非入侵红火蚁样品应该出现阳 性。这就是说利用这对引物和探针在鉴定入侵红 火蚁时可能出现假阳性和假阴性。 事例三是橘小实蝇的分子检测。台湾学者路 光晖等(2002)设计了橘小实蝇Bactrocera dorsalis 的专化性引物,用于区分橘小实蝇与其他近似的实 蝇种类n6}。2006年宁波检疫检疫局崔俊霞等人 (2006)引将此引物应用于截获实蝇幼虫和蛹样本 的快速分子鉴定中。根据上海局的试验结果,对供 试的7个橘小实蝇样品该引物只有部分阳性,部分 为阴性结果;同时对试验的其他近似种材料(菲律 宾实蝇B.philippinenisis、杨桃实蝇B.carambolae、木 瓜实蝇B.papayae)却出现了部分阳性结果,这表明 这对引物的特异性和通用性不理想。 事例四是小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controver- sa)的分子鉴定。高强等人(2005)报道了检测TCK 的引物PF/PR和探针P【l s|。根据GenBank中登录 的T.eoBtrovel'副t,T.caries和T。laevis的ETS序 列分析,理论上除了4个T.controvers8 (DQ354968、DQ354969、DQ354970、DQ35497 现阳性外,还有2个T.caries(DQ354972,DQ354972)和1个T.1aevis(DQ354976)也会出现 阳性。因此这对引物和探针在应用中有出现假阳 性的可能。 事例五是有关the/ppalmi的分子鉴定。在制 订鉴定rhrim palmi的国际植物卫生标准时,许多 学者对标准中的分子鉴定技术提出了质疑。如认 为Kox等(2005)报道的TaqMan探针的特异性不 足,不能检测到GenBank中已经登录的27个rhrips palmi中的20个,其探针序列仅仅和其中7个 rhnps palmi的C01序列完全一致。理论上,由于探 针序列和对应的rhrips palmiCOl序列之间存在2 个核苷酸碱基的差异,探针可能出现假阴性的 结果。 分析这些原因,可能有以下三个方面。首先是 分子诊断技术的标准化△▪▲□△和认可体系欠缺。由于分 子检测的一些新技术本身还不够成熟、方法相对复 杂、操作成本相对较★◇▽▼•高,操作技术要求高[19’21l,为 了安全、有效、合法进行分子检测技术的应用,美国 2010年进出境植物检疫擘术研讨会论文集 FDA曾着重检查和评估家系遗传分子诊断的方法 和实验室资历质,对实验方法的原理、步骤、应用范 围、报告方式以及临床诊断一致性等因素进行认 证,在全美范围内建立了一个完善的遗传学检验的 质量控制体系、规定报告模式和反馈信息等信息。 1995年,美国国家临床检验标准化委员会(NC- CLS)发表了关于感染性疾病分子诊断应用准则的 文件陋J。该文详细论述了分子诊断应用范围、条 件和质量控制细则。1998年,国际临床化学学会发 布了关于分子扩增(主要指PCR)在I临床诊断中应 用的质量评估基础的文件旧j。该文件肯定了PCR 作为临床常规检验技术的良好发展前景,对PCR 操作的各个环节进行了详细论述。上述两个权威 性文件都特别声明,以PCR技术为主的基因扩增 技术本身在不断发展变化,目前只能是确立某些原 则,尚难统一规定实验室质量控制标准。我国各口 岸实验室也建立了许多分子诊断方法,有些检测方 法未经严格的重复试验论证就作为行业标准中检 测方法之一,有些标准就是某某有害生物的分子检 测方法,但是这些检测方法往往存在重复性、稳定 性、成熟度和可操作性差的问题,同时也缺乏方法 学的比较研究,最终一定程度会影响检测结果的可 信度和可比性。 其次是PCR试验的假阳性和假阴性问题。在 我国临床医学诊断中,PCR的假阳性和假阴性曾导 致PCR诊断技术的一度暂停应用。假阳性和假阴 性结果部分是由于试验设计和操作的原因,更多的 是由于所用引物的通用性和特异性所引起的。同 一种有害生物的个体之间存在遗传差异,不同来源 的菌株(品系、种类等)可能在检测的目的DNA区 域存在一定的核苷酸序列变异,这就要求检测所用 引物的通用性高,能够适用于所有或尽可能多的目 的有害生物,否则容易出现假阴性。在分子检测的 实际应用过程中,既要保证引物的通用性以适合不 同来源的同一物种,避免假阴性的结果;又要严格 控制引物的特异性,引物能够区分目的有害生物与 近似物种,以保证检测目的有害生物的唯一性,否 则易导致假阳性的出现。 最后就是检测方法和引物的成熟性和□◁权威性。 一种检测方法和引物引入行标或国标之前,理论上 应该经过一定时间的检验与认可,不能简单的从文 献到文献。目前国内各个口岸检疫机构承担了大 部分的行标制订任务,但是只有部分机构或技术中 心从事相关的有害生物检测与鉴定研究,甚至有些 行标编写人员本身并没有相关有害生物的检测和 鉴定经历,有些实验室也没有相关有害生物的阳性 标本或DNA。在行标的编写过程中只能参考国内 外的文献,引用文●献中的引物探针。特别★▽…◇是针对一 种有害生物,往往有多篇文献提及多对引物,如梨 火疫病菌和玉米细菌性枯萎病菌等,国内外均有多 篇文献报道检测的特异性引物,此时需要对这些引 物进行对比研究方能确定值得推荐的引物。 此外,分子诊断技术的应用和检测结果与是否 存在检疫性有害生物活体之间还存在一个难以调 和的矛盾,那就是分子检测的阳性并不等于检疫上 的不安全。检疫所关心的是是否存在活体检疫性 有害生物,如果有害生物已经失去活力(或已不 育),那就是安全,但是此时的分子检测却往往呈阳 性。比如进口水果中,经过低温或辐射处理,水果 中携带的实蝇虫卵或幼虫已经死亡或已不育,应该 说不具有侵染性,整批水果是安全的,应该允许进 口;但是虫卵或幼虫D▲★-●NA的分子检测会出现阳性 结果。这在一定程度上,分子诊断技术和免疫学技 术一样,两者都无法区分有害生物的死活,这也正 是分子诊断技术在检验检疫中应用的最大局限 所在。 尽管如此,我们不能因噎废食,应该充分发挥 分子检测技术的优势,扬长避短,为我所用。从长 远来看,随着技术和经济的不断发展,分子诊断技 术必将朝着高效、准确、灵敏和快速的方向发展,其 技术优势和巨大潜力将以其不可比拟的强大功能 逐渐成为检疫性有害生物检测鉴定中的主要手段 之一。 参考文献 1FAO/IPPC.Gioary phytosanitaryterms.ISPM No.5。2002. 2李尉民.有害生物风险分析.北京:中国农业出版社,2003. 3许志剐.植物检疫学(第3版).北京:高等教育出版社,2008. 4周国梁,李尉民,印丽萍。等.有害生物风险分析研究工作的发 展.植物检疫.2006。20(3):162—164. 5Yamamura K.T Sugimoto.Estimation pestprevention ability 0f importplant quarantine Japan,Biometrics,1995,51,482—490. 6Bartell SM.SK Nair.Establishment mskB InvaaiveSpecies. 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